第三章 遗传的分子基础

 

  探索生命奥秘的分子生物学,包括三个方面的内容,即蛋白质体系;核酸-蛋白质体系;脂质-蛋白质体系。其中核酸-蛋白质体系的主要问题是分子遗传学,亦即本章要讨论的基本内容。

  孟德尔的试验证明了遗传物质的存在。20世纪初,摩尔根等人提出了“染色体-基因”学说,把孟德尔假想的遗传因子具体化为在染色体上呈直线排列的基因。到了20世纪40年代,随着物理学、化学和生物学的发展及新技术的应用,充分证明了构成基因的遗传物质就是核酸。这个重要的发现,把遗传学从细胞水平提高到了分子水平,从而建立了分子遗传学,有力地推动了近代遗传学的飞速发展。

 

第一节 核酸

 

  核酸(nucleic acid)是一切生物的遗传物质,分为脱氧核糖核酸(DNA)与核糖核酸(RNA)两大类。核酸是高分子化合物,其构成单位是核苷酸。通过复制,把核酸携带的全部遗传信息传给子代;通过转录和翻译使核酸所携带的遗传信息得以表达。

 

一、核酸的化学组成和种类

 

  核酸是由几十个,乃至数百万个单核苷酸(即核苷酸nucleotide)聚合而成的高分子化合物。每个单核苷酸又由三个亚基组成,即磷酸、戊糖(五碳糖)和含氨碱基。其中戊糖有核糖和脱氧核糖两种(图31)。

  含氮有机碱分为嘌呤和嘧啶两大类。嘌呤中主要有腺嘌呤(adenine)和鸟嘌呤(guanine);嘧啶中主要有胞嘧啶(cytosine)、尿嘧啶(uracil)和胸腺嘧啶(thymine)。另有一些稀有碱基,常见于某些RNADNA中,如5-甲基胞嘧啶,5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤(xanthine)和次黄嘌呤(hypoxanthine)等(图32)。

 

  戊糖与一个嘧啶或一个嘌呤碱的化学结合形成核苷(nucleosids),可用下式表示:

N+戊糖→核苷+H2O

  不同的碱基与不同核糖的化学结合,生成不同的核苷。如腺嘌呤与脱氧核糖形成的核苷,称为脱氧腺苷(deoxyadenosinedA)。同样,鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶与脱氧核糖形成的核苷,分别称为脱氧鸟苷(deoxyguanosinedG)、脱氧胞苷(deoxycytinedC)和脱氧胸苷(deoxythymidinedT)。腺嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶与核糖形成的核苷,分别称为腺苷(adenosineA)、鸟苷(guanosineG)、胞苷(uridineC)和尿苷(cytidine U)。

  核苷与磷酸结合生成核苷酸(nucleotide),核苷酸是构成核酸的基本单位。

核苷+磷酸→核苷酸+H2O

  综上,可把核苷酸的化学结构作如图33表达。

  核苷酸之间通过磷酸二酯键的连接,形成多核苷酸链(图34)。一个核苷酸糖环C3上的羟基和另一个核苷酸糖环C5的羟基,

 

 

  通过磷酸共价联合形成二酯键。2个核苷酸通过磷酸二酯键连接起来,便形成二核苷酸;三个核苷酸以同样的方式连接起来,便形成三核苷酸。很多个核苷酸通过磷酸二酯键连接起来,便形成一条多核苷酸链。该链一端糖环C3上的羟基不参与形成磷酸二酯键,称为3′末端;另一端糖环C5上连接一磷酸基,称为5′末端。多核苷酸链的这种方向性,与DNA复制和转录的方向有关,在翻译过程中,与遗传密码的阅读顺序有关。生物体内的核酸可分为两类,即核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)。它们在组成上的主要区别在于RNA分子中的戊糖是核糖,而DNA分子中的戊糖则是脱氧核酸;RNA分子中的碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶,DNA分子中的碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。

  从分子结构方面看,也有明显的区别。RNA为单股的核糖核苷酸链(偶有假双链);DNA为双股的脱氧核糖核苷酸链,即双螺旋结构。组成RNADNA的核苷酸的种类、名称详见图33

 

二、DNA的结构和功能

 

  (一)DNA的分子结构

  DNA分子是脱氧核糖核苷酸的聚合物。每个脱氧核糖核苷酸都是由一个脱氧核糖分子、一个磷酸分子和一个含氮有机碱组成。DNA分子内的碱基通常有四种:即腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶。在真核细胞生物中曾发现少量稀有碱基,如5-甲基胞嘧啶。

  如前所述,很多个脱氧核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接起来,便形成一条脱氧核糖核苷酸链,该链的一端有一个游离的3′—OH,而另一端则有一个游离的5′—PO4。因此,说DNA分子具有对称性,或说DNA分子有极性(Polarity)(图35)。

 

  1953年,WatsonCrick根据DNA的化学分析和X射线衍射资料,提出了令世人公认的DNA双螺旋结构模型(图3637)。

  这个模型充分揭示了DNA分子的结构特点:

  1.DNA分子是由两条核苷酸链,以右手螺旋方式绕着同一个中心轴,形成的双螺旋结构。两条链的走向相反(反向平行),其中一条链的磷酸二酯键是3′→5′走向,另一条链则为5′→3′走向。

  2.DNA分子中的两条核苷酸链是互补的,称为姊妹链。螺旋线的螺距为3.4nm,在这一螺距内共有10对碱基。碱基环的平面与螺旋的中心轴垂直,相邻碱基对的距离为0.34nm,像梯子的横档一样整齐排列。

 

  3.DNA分子中碱基排列完全是随机的,但碱基配对却非常专一。一个嘌呤必定和一个嘧啶配成一对,而且只能在腺嘌呤和胸腺嘧啶之间(ATTA)、鸟嘌呤和胞嘧啶之间(GCCG)进行。这样,一条链上的碱基排列顺序,可由另一条链上的碱基排列顺序来决定。核苷酸链中的4种碱基,如以全排列的方式排列,应有4nn为核苷酸数,亦即碱基数)种排列顺序。一个DNA分子中所含碱基常常不下几十万或几百万对,4种碱基以无穷尽的方式排列,规定了DNA分子的无限多样性。在这复杂多样的DNA分子中蕴藏着生物界无数的遗传信息。

 

  4.碱基之间的化学键是氢键。连接AT的氢键有两个;而连接GC的氢键则有三个。氢键是非共价的低能键,其强度取决于它们的数目。

  在遗传信息的传递过程中,DNA分子首先进行自我复制,经过减数分裂,将遗传信息传予子代细胞。

  (二) DNA的自我复制

  DNA的复制是遗传信息传递的基础,也是细胞分裂的基础。DNA的复制过程非常复杂,目前尚未完全清楚,但一般认为其过程大至如下:首先由DNA指导的RNA聚合酶,识别复制的起始点,然后在解旋蛋白(untwisting protein)的作用下,解开DNA的超螺旋结构。继而,由解链蛋白(unwinding protein)与DNA多核苷酸链结合,解开DNA的双链。尔后,以DNA为模板,在RNA聚合酶的作用下,先合成小段RNA(一般含50100个核苷酸)作为引物(primer)。DNA的复制从引物的3′—OH端开始,即按5′→3′方向,以DNA的一条链为模板,合成新的DNA片段,称为冈崎片段(一般含4002000个核苷酸)。在哺乳动物,一条模板链上可有多个合成DNA的起点。因此,同时可合成多个冈崎片段。而在另一条链上,则沿着5′→3′方向连续合成新链(也有人认为两条链都是不连续复制的)。DNA聚合酶只能沿着5′→3′的方向发挥作用。因此,在DNA的一条模板链(3′→5′)上,新链的合成是按着5′→3′方向连续进行;而在另一条模板链(5′→3′)上,新链的合成是随着DNA分子双螺旋的核苷酸链不断被打开,以“倒退”的方式合成不连续的DNA片段(即冈崎片段)(图38)。

  DNA聚合酶有三种(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)。在合成DNA的过程中,起重要作用的是DNA聚合酶Ⅲ。合成DNA时,还需要四种脱氧核苷三磷酸为原料,在Mg2+参与下完成,如下式:

 

 

  上式中 dATP dCTP dGTP dTTP,分别为脱氧腺苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸和脱氧胸苷三磷酸。dAMPdCMPdGMPdTMP,分别为脱氧腺苷一磷酸、脱氧胞苷一磷酸、脱氧鸟苷一磷酸和脱氧胸苷一磷酸。ppi为焦磷酸。

  DNA片段合成后,由核酸酶将引物切除,然后由DNA聚合酶合成一定的核苷酸序列填补由原引物所占位置。最后由DNA连接酶(DNA ligase)通过酯化相邻核苷酸的5′—P3′—OH末端,形成磷酸二酯键,将核苷酸片段连接起来,形成新的多核苷酸长链。

  复制后形成的两个DNA分子中,各有一条链是原有的,另一条链是新合成的,故称半保留复制。子代DNA分子中的碱基排列顺序与亲代DNA分子完全一样。

  (三) DNA是遗传物质

  遗传物质必须具有相对的稳定性;能够精确的自我复制,使亲代与子代间保持遗传的连续性;能够指导蛋白质合成,控制新陈代谢过程和性状发育;在特定条件下产生可遗传的变异。

  大量的科学实验证明,DNA是具备上述条件的遗传物质。

  1.DNA是遗传物质的间接证据

  1DNA通常只能在细胞核的染色体上找到,生殖细胞中DNA的含量是体细胞内DNA含量的一半。DNA含量的这种变化情况,与生殖细胞和体细胞内染色体数量的变化有对应平行关系,蛋白质等物质不具备此种量变特点。

  2)同一种生物,不论年龄大小,不论是身体的哪一种组织,在一定条件下,每个细胞核里的DNA含量,基本上是相同的。而其他物质,包括RNA和蛋白质,在细胞生长的各个阶段,含量变化都比较大。

  3DNA不仅在量上恒定,在质上也恒定,其他物质不具备此种特点。例如,某些鱼类,它们染色体的蛋白质一般都是组蛋白。而在成熟的精子中,组蛋白完全匿迹,而代之以精蛋白。可见蛋白质在量上是不恒定的,不符合遗传物质对稳定性的要求。

  4)各类生物中,凡能改变DNA结构的化学或物理学因素,都可导致突变。紫外线诱导生物发生突变的有效波长,与DNA对紫外线吸收光谱的波长一致,都是260 nm左右。

  2.DNA是遗传物质的直接证据 以微生物为例,证明遗传物质是DNA(有时是RNA)。

  1)转化(transformation):所谓转化是指一种生物,由于接受了另一种生物的遗传物质(DNARNA)而表现出后者的遗传性状或发生遗传性状改变的现象。F.Criffitn1928)用肺炎双球菌的两个品系SⅢ和RⅡ为实验材料,首先发现了细菌的转化。 SⅢ型的特点是菌落光滑,细胞有荚膜,具有毒性,能致小鼠死亡;RⅡ型的菌落粗糙,无荚膜,无毒性,不能致小鼠死亡。上述性状都是稳定遗传的。F.Criffitn的实验过程见图39

 

  O.T.Avery1994)等人,把SⅢ型肺炎球菌细胞中的DNA、蛋白质及荚膜物质提取出来,分别加入到培养有RⅡ型细菌的培养基中,发现只有DNA能使少量RⅡ型细菌转化为SⅢ,并能稳定的遗传下去。但从SⅢ型细菌中提取的蛋白质,荚膜物质,或将分离后得到的DNA,用DNA酶处理后,都没有上述转化作用。这便有力的说明了遗传物质是DNA,而不是蛋白质或其他物质。

  2)噬菌体的浸染与繁殖:噬菌体是侵袭细菌的病毒。当T2噬菌体浸染大肠杆菌时,首先将其尾部与细菌的细胞壁粘接,随后将其体内的染色体注入细菌体内,其蛋白外衣则留在细菌体外。感染后不久、细菌体内的DNA便停止活动。经数分钟的潜伏后,便以注入细菌体内的噬菌体DNA为模板,合成DNA与蛋白质,形成新的噬菌体,最后导致细菌细胞壁破裂,释放出100200个新噬菌体(图310)。该F1代噬菌体又去浸染邻近的细菌,产生F2代噬菌体。

 

  上述事实说明,只有DNA才是亲代和子代之间具有连续性的遗传物质,它携带着亲代的全部基因,控制着子代的发育。

  3)病毒的重建:有些种类的病毒只含RNA,不含DNA。在这种情况下RNA也具有遗传物质的功能。烟草花叶病毒的重建试验提供了充分证据。

  烟草花叶病毒(TMV),由许多相同的蛋白质亚单位组成,亚单位螺旋形排列成圆筒状,筒壁内嵌入一个螺旋形的RNA分子(图311)。

  用化学分部分离法将蛋白质和RNA分离,用分离得到的RNA浸染正常的烟草植株,结果产生病毒后代,蛋白质则不能。如用RNA酶处理分离得到的RNA,则其浸染能力就完全被破坏。不难说明复制和形成新的病毒所必须的基因在RNA上。因此,RNA对于这些病毒而言,便是遗传物质。

 

 

三、RNA的结构和功能

 

  前面讲到DNA与遗传信息的贮存和传递有关。但遗传信息的表达,也就是各种功能蛋白质的合成,与核糖核酸(即RNA)有密切关系。

  根据在合成蛋白质中所起作用的不同,可将生物体内的RNA分为以下三种:

  (一)信使RNAmessenger RNAmRNA

  mRNARNA总量的5%左右,相对分子质量差别很大(20万~200万不等),沉降系数在8s30s之间(沉降系数越大,相对分子质量越大)。在细胞核中形成后转移到细胞质中,将从DNA分子上转录的遗传信息带到核糖体上,作为合成蛋白质的指令,故称信使RNA

  mRNA分子链长短各异。单链的mRNA分子有时回折,使自身的一部分碱基相互配对,形成局部的双链区段,致使其分子的外形具有独特的形状。例如,MS2噬菌体mRNA的形状像一枝花;Qβ噬菌体mRNA分子的形状又像一棵枯树。

  mRNA的寿命很短,周转率高。真核细胞mRNA的半寿期可达几十小时,而原核细胞mRNA的半寿期,往往只有几分钟。

  (二)转移RNAtransfer RNAtRNA

  tRNA的分子较小,一般由7585个核苷酸组成,相对分子质量2.53.0万,沉降系数为4s。约占细胞内RNA总量的5%~10%。

  tRNADNA转录时,先形成较大的前体,经加工后形成成熟的tRNA。其加工过程可分为切除、修饰和加接C.C.AOH三个阶段。参与第一阶段的内切酶有RNasepRNaseQ两种。修饰过程分两步进行:第一步是把tRNA前体中某些尿苷转变为假尿苷及二氢尿苷;第二步是使某些核苷甲基化;最后阶段是在tRNA核苷酸转移酶(tRNA nucleofidyl transferase)作用下把-C.C.AOH加接到tRNA前体的3′末端,形成成熟的tRNA(图312)。

 

  tRNA分子是单链的,可是其中半数以上的碱基却像DNA分子那样,通过碱基配对(AUGC)拼成双链,以致使一条多核苷酸链折叠成三叶草型(图3173)。

 

  近年来,有人研究了tRNA分子的空间构型,发现tRNA分子形若倒置的字母“L”(图314)。

  tRNA的碱基组成中,含较多的稀有碱基,如次黄嘌呤(Ⅰ)、假尿嘧啶(Ψ)等,以及某些正常碱基的甲基化形式。这些稀有碱基中,有些不能形成通常的碱基对,从而形成半环状结构。半环分为:(1)二氢尿嘧啶环(D环);(2)反密码子环,其上的三个碱基组成反密码子,能识别mRNA上的密码,参与蛋白质合成;(3)胸腺嘧啶环(TΨC);(4)在反密码子环与TΨC环之间,有一长短不等的额外环;(5)与反密码子环相对应的一端,称为氨基酸臂,为活化的氨基酸连接部位。

  (三)核糖体RNAribosomalRNArRNA

  rRNADNA转录时,先形成较大的前体,然后再形成成熟的rRNA。它是细胞中另一种形式的RNA,其含量约占细胞内RNA总量的80%以上。rRNA与蛋白质结合形成核糖体。原核生物核糖体的沉降系数为70s,由30s的小亚单位和50s的大亚单位组成。真核生物核糖体的沉降系数为80s,由40s的小亚单位和60s的大亚单位组成。原核生物核糖体小亚单位由16sRNA21种蛋白质构成;大亚单位由23sRNA5sRNA34种蛋白质构成(图315)。核糖体是细胞内蛋白质合成的场所。

 

第二节 遗传信息的传递及基因调控

 

  遗传密码是从固定起点开始的不重叠的三联体碱基码组。在64个可能的密码子中,有61个为20种氨基酸编码,余下的3个三联体密码为肽链合成的终止信号。

  遗传信息的转录,即指以DNA单链为模板,沿着5′→3′的方向,按着碱基互补的原则合成RNA的过程,是细胞中遗传信息表达的开始。

  氨基酸由tRNA运入核糖体,并与mRNA形成复合物,开始进入遗传信息的翻译过程,即蛋白质生物合成,亦即遗传信息的表达。

  遗传信息从DNA传递给RNA,再从RNA传递给蛋白质的过程,以及遗传信息从DNA传递给DNA的复制过程即所谓中心法则。

 

一、遗传密码

 

  蛋白质的种类繁多,但构成蛋白质的氨基酸却只有20种,这些氨基酸首先连接形成肽链,然后形成具有一定空间结构的蛋白质,各种蛋白质的差异主要表现在多肽链中氨基酸的数量、种类和排列顺序的不同。有关遗传密码的最初设想是建立在蛋白质与核酸具有共同的链状结构的基础上的。构成蛋白质的多肽链中,氨基酸有特定的序列;构成DNARNA的核苷酸链中的核苷酸(或碱基)也有特定的序列。既然蛋白质的特异性是由遗传物质DNA所决定,那么一定是DNA分子中的核苷核(或碱基)序列,通过mRNA中核苷酸(或碱基)序列决定了蛋白质中的氨基酸序列。这就是1958年由Crick提出的序列假说。

  DNA分子中的两条链是碱基互补的,其中只有一条链作为合成mRNA的模板。因此,通常所说的遗传密码是指DNA一条链上的碱基序列,或只指单链mRNA上的碱基序列。然而,碱基只有4种,氨基酸却有20种,如果一种碱基决定一种氨基酸,那么4种碱基只能决定4种氨基酸;如果两个碱基为一组,也只有(42=16个密码,仍不能满足20种氨基酸的要求;如果每个密码组内有3个碱基,那么,便有(43=64个可能的组合,足可为20种氨基酸编码。这种推论,被后来的实验证实。于是便提出了由3个碱基组成1个氨基酸密码的三联体理论。即DNA分子中以3个碱基字母组成一个密码。因此,称为三联体密码(tripletcode)。每个三联体(如AAA)在mRNA上的副本(UUU)称为一个密码子(codon)(表31)。

 

  由上表可见,在64个三联体中有61个是各种氨基酸的密码。每种氨基酸可以有一个或几个密码。如甲硫氨酸只有一个密码。即AUG,若该密码在mRNA的起始端,既为蛋白质合成的起始信号,亦称起始密码子。另外还有三个密码:UAAUAGUGA,不决定任何氨基酸,称无意义密码,但在蛋白质合成过程中。如mRNA上出现这三个密码中的任何一个时,肽链的合成即行停止,所以又称这三个密码为终止密码。遗传密码的特点:

  (一)遗传密码的通用性

  地球上所有的生物,从细菌、病毒到最高等的人类,都具有统一的遗传密码。

  (二)遗传密码的间并性

  从表31可见,同一氨基酸可有好几个密码,此即遗传密码的间并性。例如苯丙氨酸的密码子有2个,而丝氨酸的密码多至5个。

  (三)遗传密码的变偶性

  由表31可见,除色氨酸和甲硫氨酸外,每个氨基酸可有26个三联体密码子。除精氨酸和丝氨酸外,同一氨基酸的不同密码子仅在第三个碱基上有差别。显然,密码子的专一性主要是由前两个碱基决定,而第三个碱基就不那么重要了。据此,Crick1966)提出了变偶(摆动)假说(Wobble hypothesis)。认为:tRNA反密码子环上的第3碱基(5-端碱基)在与mRNA上的密码子互补配对时,不是严格的按着AUCG的互补原则,而是有一定范围的变动(变偶)。同时还发现,在tRNA的反密码子中除AGCU四个碱基外,还有第五个碱基,即次黄嘌呤(Ⅰ)也经常出现。Ⅰ可与UAC三个碱基配对,这便增加了tRNA上反密码子阅读mRNA上密码的能力。

 

二、遗传信息的转录

 

  转录过程是以DNA的一条多核苷酸链(有意义链)为模板,合成RNA的过程。因此,新形成的RNA与模板DNA的一条链互补,亦即DNA分子的碱基序列决定着RNA分子中的碱基序列。通过转录,贮存在DNA分子中的遗传信息,便如实的“记录”在RNA分子中。

 

  转录过程与DNA复制过程有某些相似之处。它是以DNA的一条链为模板,沿着5′~3′的方向,在RNA聚合酶(RNA Polymerase)的作用下,按着碱基互补原则合成与DNA链互补的RNA链(图316)。所不同的是:转录只在一条多核苷酸链上进行,因此RNA总是单链的。但有意义链不是固定不变的,即有时是甲链的一段,有时又可能是乙链的一段;合成RNA的酶主要是RNA聚合酶,而不是DNA聚合酶;RNA聚合酶不需要“引物”;RNA分子中与DNA模板链A互补的碱基是U,而不是T。例如, DNA分子中有意义链的碱基序列为3′-TACAAC5′,转录形成的RNA分子中互补的碱基序列为5′-AUGUUG3′。

  RNA聚合酶是由4个多肽链组成的一种复合酶,全酶的相对分子质量约为5万,有两个相同的α链,一个β链及一个β′链和一个δ因子组成。这个全酶的通式为α2ββ′(图317)。没有δ因子,则称核心酶。

  转录时δ因子本身不结合到DNA上,也不具催化活性,但能使全酶识别并结合到DNA双链中一条链的特异核苷酸序列,即启动子的位置上,或说δ因子能辨认模板链上的起始位点,促使转录进行。当转录开始后,δ因子便从全酶上脱落下来,再与新的核心酶结合而被循环使用。脱去δ因子的核心酶使转录中的RNA沿着5′-3′的方向继续延长(图316)。

 

  RNA转录的终止,是受另外一种蛋白质因子P所控制。P因子能识别DNA模板链上的另一特殊的核苷酸序列,即终止信号或称终止子(terminator)。当RNA聚合酶的核心酶,“推进”到终止子时,P因子既与之结合,并在识别终止子后停止了RNA链的延长。

三、遗传信息的翻译

 

  遗传信息的翻译是指在蛋白质合成过程中,各种氨基酸按mRNA的密码序列,相互结合形成肽链,从而决定蛋白质一级结构的过程。在此过程中需要mRNAtRNA、酶、蛋白质因子和核糖体参与。

  蛋白质的合成过程,可大致的分为4个阶段:(1)氨酰-tRNA的合成;(2)肽链合成的起始;(3)肽链的延伸;(4)肽链合成的终止。

  (一)氨酰-tRNA的合成(氨基酸的活化)

  氨基酸不能自动结合形成肽链,需有酶促作用获得能量而被活化(activation)后才能结合成肽链。该活化过程分两步完成。

  1.氨基酸的活化是在特异的氨酰-tRNA合成酶(aminoa-cyltRNA synthetase)催化下完成的。活化过程第一步是氨基酸在氨酰-tRNA合成酶的作用下,与腺苷三磷酸(ATP)结合形成氨酰腺苷酸——活化酶复合物。如下式:

 

  2.氨基酸-AMP-酶复合物为中间产物,在有相应的tRNA存在时,由氨酰-tRNA合成酶催化形成氨酰-tRNA,其反应过程如下式:

 

氨酰-tRNAAMP+

  上面两个反应过程可简写成如下反应式:

氨酰-tRNAAMPPPi

  氨基酸活化实际上是氨基酸的羧基与tRNA3′末端腺苷酸中核糖上的2′或3′位羟基以酯键相结合,从而使氨基酸连在tRNA上面(图318)。

  (二)肽链合成的起始

  肽链的合成步骤,在研究过的生物中基本相似。在大肠杆菌中,肽链合成开始时,在起始因子3F3)的作用下,核糖体30s亚基识别mRTA的起始密码子AUG,并与之结合形成复合物Ⅰ(图319)。

  在起始因子1和起始因子2作用下,带有甲酰甲硫氨酸的tRNA(甲酰甲硫氨酰-tRNA),因其反密码子UAC与起始密码子AUG碱基互补,而识出起始复合物mRNA上的起始密码,并与之结合形成起始复合体Ⅱ(图320)。

 

  起始复合体Ⅱ与核糖体50s亚基结合,形成完整的70s核糖体,即复合体Ⅲ(图321)。

 

  70s核糖体有两个活性部位,一个是氨酰基附着位置(aminoacyl attachmcent site,“A”),也称A位或受位;另一个是肽基部位(peptidyl site,“P”位),也称P位或供位(图322)。

  起始的甲酰甲硫氨酰-tRNAfmettRNA)总是与P位(供位)相结合。第二个氨酰-tRNA(丙氨酰-tRNA)则是结合在A位(受位)上。

  当第二个带有氨基酸的tRNA进入复合体Ⅲ时,就开始了肽链延长阶段。

  (三)肽链的延长

  进入复合体Ⅲ的带有丙氨酸的tRNA,在肽链延长因子(elongation factor,“EF”)EF1的作用下,与核糖体的A位相结合,此称进位反应。丙氨酰-tRNA的反密码子CGImRNA上的第二位密码子GCU互补配对,形成复合体Ⅳ(图323①)。随后由肽基转移酶(peptidyl transferase)的催化转肽作用,使P位由fmettRNA所携带的甲硫氨酸脱离了所在P位的tRNA挂接到A

 

  tRNA上,形成复合物Ⅴ(图323②),此称转位反应。P位上的tRNA失去氨基酸后从核糖体上脱落下来。在肽链延长因子2(也称转座酶trans posase)作用下,核糖体向mRNA3′端挪动相当于一个密码子(三个核苷酸)的距离。使原来在受位(A位)上带有两个氨基酸的tRNA移至供位(P位),同时使空出来的受位准确的定位于mRNA上的第三位密码子,形成复合物Ⅵ(图323③)。此反应过程称为移位。

  此后,肽链上每增加一个氨基酸残基,便按着下列四个步骤进行:(1)新的氨酸-tRNA进入受位(进位);(2)经转位使肽链延长;(3)转肽后供位上的tRNA脱落;(4)在核糖体向mRNA3′方向移动一个密码子距离(移位)的同时,原处于受位上的带有肽链的tRNA随之移至供位。上述过程重复进行,直至肽链增加到一定长度(图323⑤)。肽链延长的各步骤都需要有GTPguanosine triphosphate GTP鸟苷三磷酸)和Mg2+参与,才能顺利完成。

  肽链延长迅速,如大肠杆菌生长在适宜的条件下,每20秒钟可形成一个约40个氨基酸的肽链。

  真核细胞肽链延长阶段的各步骤与原核细胞肽链延长各步骤相似,在此不予赘述。

  (四)肽链合成的终止

  从图323⑤(即复合体Ⅷ)可以看到,受位上出现了终止信号UAA(或UAGUGA),因为没有一种tRNA具有和这三个密码子中任何一个相对应的反密码子。因此,肽链合成便告结束,从此时起进入终止阶段。终止信号可被终止因子(RF)所识别,并进入受位与终止信号结合形成复合体Ⅸ(图324)。

  终止因子进入受位,限制了多肽转移酶的催化转肽作用,并使已合成的多肽链从供位的tRNA上释放出来,形成复合体Ⅹ(图325①)。

 

 

  多肽链脱离核糖体后,在核糖体释放因子(ribosome relesingfectoiRR的作用下,使核糖体与mRNA脱离的同时tRNA和终止因子RF也脱落下来(图325②),脱离下来的核糖体在起始因子3的作用下分解成50s亚基和30s亚基(图325③),它们重又进入蛋白质合成过程。

  在活细胞中,每条mRNA分子上都带有许多核糖体,亦即有许多个核糖体成串排列在mRNA分子上,形成多聚核糖体。例如,血红蛋白的多肽链,每条大约含150个氨基酸,相当于mRNA450个核苷酸,在这条mRNA分子上,同时有56个核糖体。

  多聚核糖体上的每个核糖体从mRNA一端的起始点开始合成蛋白质,当它们沿着mRNA行进时,翻译形成越来越长的肽链,直至mRNA另一端的终止信号时,才从mRNA上脱落下来,同时释出多肽链。因此,多聚核糖体上的每一个核糖体都携带一条处于不同阶段合成的肽链。距起始信号最近的核糖体上的肽链最短,距终止信号最近的核糖体上的肽链最长。结果,在一个mRNA分子上可同时翻译几条同样性质的肽链(图326)。

  根据上述蛋白质的合成过程,肽链的第一个氨基酸应是甲酰甲硫氨酸,可实际上,在蛋白质中并没有找到甲酰甲硫氨酸。原因是在蛋白质合成过程中或合成后,由氨基肽酶将链首的甲硫氨酸残基(甚至可能是更多的氨基酸)水解除去。

  多肽链合成后,并不意味着具有生理功能的蛋白质(或酶)已经形成,尚须经过下列过程:

  1.加工 即将合成的肽链切除一部分。例如,酶原在去除部分肽段后,成为有活性的酶。又如,激素原变成有活性的激素,白蛋白原转变成为白蛋白等。该加工过程多在细胞内高尔基体中进行,有些则在细胞外(如酶原→酶)完成。

  2.修饰 蛋白质合成后,有时需要进一步磷酸化、糖基化、羟化、甲基化或乙酰化,才能形成具有生理活性的蛋白质,这一过程称为修饰。

  3.聚合 多肽链自行卷曲、螺旋或折叠,并借助盐键、氢键、二硫键的连接维持空间构形。有时还要结合一些辅基。例如,血红蛋白AHDA)就是合成的α链先与尚未脱离核糖体的β链相连,β链释出后即已形成有αβ二[]体,然后与2个血红素分子结合。最后,2个带有血红素的αβ二[聚]体再结合成为立体构型的α2β2HbA)。

 

 

四、中心法则及其发展

 

  如前所述,可以把DNA、RNA和蛋白质的关系概括为以下三点:

  (1)DNA链上的核苷酸有一定序列,这序列就是遗传信息;

  (2)DNA双链拆开,以每条单链为模板,按着碱基互补配对的原则,合成新的互补链,此即DNA的复制;

  (3)以DNA双链中的一条为模板,互补的合成mRNA,此即转录。然后以三个核苷酸决定一个氨基酸的方式,根据mRNA的核苷酸序列合成多肽,这是翻译。

  以上几个方面就是中心法则(central dogma)的内容。中心法则强调了遗传信息的一般流向:遗传信息由DNA传向DNA,或由DNA传向RNA,然后决定蛋白质的特异性;遗传信息不可能从蛋白质传向蛋白质,或由蛋白质传向DNA、RNA。因此,遗传信息的一般流向可用图3-27表示:

 

  由于研究工作的不断深入,中心法则也有了新的发展,很多RNA病毒,如小儿麻痹症病毒、流感病毒、双链RNA噬菌体及多数单链RNA噬菌体,在感染宿主细胞后,它们的RNA在宿主细胞内进行复制,这种复制是以导入的RNA为模板,而不是通过DNA。如用放线菌素D处理宿主细胞,抑制其DNA的复制与转录。但并未影响RNA病毒的产生,这表明病毒RNA的复制并不通过DNA。

  现在知道,以RNA为模板的RNA合成,即RNA复制,是由RNA依赖的RNA聚合酶(RNA polymerase)来催化的。每种RNA病毒都有自己的独特的复制酶,由自己的基因编码。Spiegel-man等人从感染大肠杆菌的噬菌体Qβ中分离得到了该RNA聚合酶,并在此基础上通过实验,充分证实了RNA也可以作为模板,由RNA复制RNA。

  以后Temin等发现,某些引起肿瘤的单链RNA病毒,如rous肉瘤病毒(rous sarcoma virus)和rauscher小鼠白血病病毒(rauschermouse leukemia virus)等能以病毒RNA为模板,反向合成DNA,然后以这段DNA为模板,转录形成RNA。因为这类病毒以RNA为模板反向转录DNA,所以特称反转录病毒(retrovirvs)。由前所述,现在可把中心法则作如下修改,即把 DNA、RNA和蛋白质的关系以图3-28形式表示:

 

  遗传信息可由RNA传向DNA,这在遗传信息的传递问题上开辟了一条新的途径。可以说是中心法则的一项重要的新发展。鉴于生物的多样性,随着科学研究的不断深入,对中心法则的进一步补充、发展,也是意料之中的事。

 

五、蛋白质与性状

 

  DNA是遗传信息的物质载体,大量遗传信息以三联体密码语言方式贮存在DNA分子内,形成DNA分子语言,由于DNA分子中碱基排列的无限多样性,确定了遗传信息存量无限巨大的可能性和DNA分子语言的多样化。成为生物种类多样,乃至同种生物不同个体间性状千差万别的内在根据。

  和其他信息一样,遗传信息也是可以传递的,但因信息内容的特殊性,其传递方式有别于其他信息(图3-29)。

  遗传信息通过转录、翻译,形成的终产物是结构和功能各异的、表现生物体性状的蛋白质。亲代传给子代的是遗传信息,而不是性状。DNA是遗传信息的载体,它的主要作用是控制蛋白质合成,从而控制性状的发育。

  蛋白质是构成生物体的主要成分,即使在比较简单的有机体,如大肠杆菌也约有2000种不同的蛋白质。而在人体中的蛋白质,

 

 

  据估计要超过10万种之多。这些蛋白质的组成成分和结构各异,在细胞或体内执行的功能不同,导致一系列错综复杂的代谢变化,最后表现为复杂的性状。

  酶是生物体细胞内一种具有特殊催化作用的蛋白质。自然界一切生命现象都与酶的参与有关。新陈代谢过程的各阶段,都必须在酶的催化作用下进行,从而受到酶的严格控制和调节。例如,人体皮肤和眼球的黑色素,是由酪氨酸酶催化生成的。如缺乏这种酶就不能形成黑色素,呈现白化性状,即皮肤和毛发皆成白色,瞳孔显示红色,不能耐受日光照射。

  多数哺乳动物的细胞色素C含有104个氨基酸,如把不同种生物的细胞色素C中的氨基酸成分和人的细胞色素C作一比较(表3-2)。

 

  由表3-2可以看出,愈是在进化系统中接近于人类的那些生物,其细胞色素C中的氨基酸成分,也愈是和人类相近似。例如,猕猴和人类的细胞色素C只有一个氨基酸的差别;而酵母和人的细胞色素C则有44个氨基酸不同;黑猩猩和人类的细胞色素C成分,则完全相同。

  人类的血红蛋白由4个多肽链组成。其中两条α链各由141个氨基酸组成,两条β链各由146个氨基酸组成。当正常人血红蛋白β链第6位的谷氨酸被缬氨酸取代时,则出现镰形细胞贫血症。其红细胞呈镰刀形,出现严重贫血、发育不良、关节和肌肉疼痛等症状。

  促性腺激素(gonadotropic hormone GSH),是由男性腺垂体产生的一种糖蛋白类激素。有刺激睾丸间质细胞,促进睾酮(testosterone)分泌,使持续形成精子之功能。但在XXY个体,因靶器官(睾丸)对促性腺激素反应减弱,或根本无反应而致个体尿中,促性腺激素的排出量增加。

六、基因的本质及调控

 

  (一)基因的本质

  在染色体中高度盘曲的DNA分子,是一条很长的双链。最短的DNA分子大约含4000个核苷酸对,最长的大约含40亿个。据估计,人的染色体总长不到0.5mm,而在染色体中高度盘曲的DNA分子,却是一条长达数米的双链。一个DNA分子可以看作是很多区段的集合,这些区段一般不互相重复,每段大约有500~6000个核苷酸对,这样的一个区段就是一个基因。或者说一个基因是含有几百个或几千个碱基对的一段DNA。例如决定人生长激素的基因由188个三联体密码组成,包括564个碱基。基因的起始密码子是AUG,终止密码子为UAA、UAG或UGA。相邻基因间常有一段间隔区,它不能进行转录。

  在一个基因内部,存在若干起作用的单位。依其性质与作用可区分为①作用子(或称顺反子cistron),是基因的主要部分,是一个功能单位。一般情况下,一个作用子决定一种多肽链的合成。一个基因中可能包括几个作用子(多作用子基因),也可能只有一个作用子(单作用子基因)。②突变子(muton),是指一个基因内部能发生突变的最小单位,有时一个作用子中包含若干个突变子。③重组子(或称交换子recon),是最小的重组合单位。

  根据DNA分子一定区段(基因)的功能差异,基因可分为:

  1.结构基因(structural gene)决定某种蛋白质分子结构相应的一段DNA,它把负载的遗传信息转录给mRNA,再以mRNA所携遗传指令合成有特定氨基酸序列的蛋白质。因此,结构基因直接与性状的发育和表现有关。

  2.调节基因(regulator gene)调节蛋白质合成的基因。它能使结构基因在需要某种酶时就合成这种酶,不需要时便停止合成。

  3.操纵基因(operator gene)操纵结构基因的基因,位于结构基因(一个或多个)的一端,控制结构基因的活动。当操纵基因“开动”时,它所控制的结构基因便开始转录和翻译;当其“关闭”时,结构基因就停止活动。

  调节基因和操纵基因都有控制结构基因的作用,但它们之间又有区别,调节基因可调节不同染色体上的结构基因,而操纵基因只限控制同一染色体上的结构基因。

  随着遗传学研究的深入,基因的概念也在不断发展。现代基因的概念是:基因是DNA分子上一段特定的核苷酸序列,它具有突变、重组、转录或对其他基因起调控作用的遗传学功能。概括的说,基因就是DNA分子上具有一定遗传效应的一段特定的核苷酸序列。

  (二)基因的调节和控制系统

  人类个体的生长、发育始于受精卵。受精卵的基因组(genome)含有形成成年机体的全部遗传信息。个体发育的主要特征是细胞分化(cell differentiation),已分化的细胞仍然具有全部遗传潜能。然而,在任何一个细胞中,并非全部基因都能表达,而是在一定时间和条件下,只有部分基因有秩序的进行转录和翻译。这是受精卵卵裂后,逐渐分化为各种细胞、组织和器官的遗传学基础。这说明对基因的表达存在着一个调控系统。

  1.原核类基因表达的调控系统 原核类基因表达的调控主要是在转录水平进行。Jacob和Monod(1961)的操纵子学说(operon theory),就是说明细菌系统在转录水平调控基因表达的典型例证。下面以乳糖操纵子为例作具体介绍。

  操纵子是由多数基因构成的更大遗传单位,是调节和控制某一生化代谢过程的基因集团。在一个操纵子中,一般都有三种基因的遗传单位,即结构基因、控制基因和调节基因。

  乳糖在大肠杆菌细胞内,被分解为葡萄糖和半乳糖。参与该过程的三种酶是由乳糖操纵子中的三个结构基因决定的。①lacZ决定半乳糖苷酶,催化乳糖水解为葡萄糖和半乳糖;②lacY决定半乳糖苷透膜酶,促进乳糖进入细胞,加速乳糖利用率;③lacA产生乙酰转移酶,功能不详。大肠杆菌乳糖操纵子中的结构基因(Z、Y、A)紧密联锁。

  控制基因由启动基因(promoter)和操纵基因(operator)组成。启动基因无基因产物,是RNA聚合酶附着部位。操纵基因也无基因产物,为阻抑物附着的部位,它能控制结构基因转录的启闭。调节基因能转录出自己的mRNA,并能翻译为相应的蛋白质,即阻抑物(repressor)。调节基因可调节位于不同染色体上的结构基因。

  阻抑物是一种变构蛋白质,它的分子上有两个特异部位:一个部位可识别操纵基因区的特异核苷酸序列;另一个部位可识别诱导物(inducer)。当大肠杆菌的培养基内有乳糖存在时,乳糖与阻抑物结合并改变其构型,使不能附着于操纵基因上,从而放行附着于启动基因的RNA聚合酶,于是结构基因便开始转录、翻译,产生半乳糖苷酶、半乳糖苷透膜酶和乙酰转移酶。乳糖被分解为葡萄糖和半乳糖(图3-30)。

 

  当培养基中的乳糖完全被分解后,代谢终产物(半乳糖)便与阻抑物结合,但因不会改变其构型,所以能附着于操纵基因上,结果阻碍附着于启动基因的RNA聚合酶沿着DNA模板运动,而使结构基因转录停止(图3-31)。这样的基因调节系统,使大肠杆菌的活动更有效的适应环境因素的变化。

 

  2.真核类的基因调节系统 由于真核细胞在结构和功能方面远较原核细胞复杂,在许多方面与原核细胞有着本质差别,所以尽管对原核生物基因表达的调节、控制,目前已有了比较深入的了解,但若把这些知识直接运用于真核细胞还须十分慎重。事实上,前面谈到的操纵子学说,在真核生物中迄今尚未确证其存在。

  真核细胞中转录和翻译的部位,在空间上是分开的,在时间上是次递连续的。转录发生在细胞核内,而遗传信息的翻译则是在细胞质中进行。因此,遗传信息在真核细胞内有一个转移过程。这一过程包括:DNA转录形成前体RNA;前体RNA的加工和运输;有功能的RNA在细胞质内形成翻译的复合物。这一过程的每一阶段都需作适当的调节才能形成表型产物。在时间上可以把这种多阶段的调节过程,大致划分为转录水平的调节和转录后的调节。转录后的调节又包括前体RNA的加工和运送、翻译及翻译后的调节。鉴于真核生物基因调控的复杂性,这里仅就激素对转录水平的调节作一简单介绍。

  女性胎儿的卵巢中,已具备全部卵子的前体细胞(卵母细胞)。然而,在出生后12年左右的时间内,却一直停留在第一次减数分裂的中期阶段。由于青春期到来,激素水平的升高,卵母细胞(常每月一个)开始生长、发育,完成第一次减数分裂,开始第二次减数分裂,最后发育成为成熟的卵子。这里,激素是基因表达的调控物质。

  月经周期中,由于雌性激素增加,子宫内膜细胞积极合成RNA,继而合成蛋白质,结果表现为子宫内膜增厚。这一应答性反应可被放线菌素D结合于细胞核的DNA,阻抑了mRNA的转录,细胞的蛋白质合成便告停止。这一事实表明雌性激素是基因转录的调控物质。

  目前认为,甾体激素对基因的调控过程,可分为如下四个步骤:

  (1)激素分子扩散入细胞,与细胞内的受体结合,形成激素-受体复合物;

  (2)激素-受体复合物进入细胞核;

  (3)进入细胞核的激素-受体复合物,选择性的与染色体特定位点上的非组蛋白类蛋白质结合后脱离了DNA,使这部分DNA裸露出来;

  (4)基因启动,进行转录,产生前体mRNA,经过改造、加工成为成熟的mRNA,进入细胞质并与核糖体结合,进行翻译,产生特异性蛋白质(图3-32)。

  近年,许多学者提出一些真核生物细胞基因调控系统模型。现选一被大多数人接受的模型为例作一介绍。按照这个模型的观点,在DNA分子中有一个感受基因(sener gene),它与激素受体复合物作用后即被活化,并因此导致邻近的整合基因(integratl gene)亦被活化。整合基因活化后,可转录生成有活性的RNA。这个有活性的RNA能够有选择的识别接受器(receptor)的基因,并与其互作,遂使与接受基因毗邻的一个发生基因(producer gene)解除抑制,进而转录合成mRNA,并经翻译形成相应的蛋白质(图3-33)。在这个调控系统中,一个感受基因可控制数个整合基因。

 

第三节 遗传工程简介

 

  遗传工程(genetic engineering)是近年来,随着分子遗传学的发展而形成的新的分支学科,也是人工改造生物遗传特性的一种新的科学技术。这一新技术为人类提供了按自身需要加工、转移遗传物质,控制生物遗传特性和创造新品种提供了可能。

  广义的遗传工程包括:①细胞工程(cellular engineering)。通过细胞融合(cell fusion)即细胞杂交(cell hybridization)来探索遗传变化或通过细胞器的转移来研究其功能。②染色体工程(chromosomal engineering)。即分离提取某一染色体或某一段染色体,然后将其转移至另一细胞来分析其遗传效应。③基因工程(genetic engineering)。是建立在分子遗传学理论基础之上,以控制性状遗传的基因为操作对象,按着预先的构想,在严格控制条件下完成基因转移,达到改造遗传性目的的过程。

  综上,所谓遗传工程,即根据遗传学的原理,采用类似工程设计的方法,对生物遗传物质进行有计划的技术操作,从而达到定向改造生物遗传组成,使其获得新的遗传性状,这一过程称为遗传工程。

 

一、细胞融合工程

 

  细胞融合工程是把两种生物的体细胞相互融合,使它们的细胞核与细胞质彼此结合,形成杂种细胞,故又称体细胞杂交。这一研究首先在动物方面获得成功,使人与鼠、人与蚊的体细胞融合。后来在植物方面亦获成功,以后又经进一步发展,使植物的原生质体与人类细胞的融合也获成功。这项研究成果,打破了生物种、属、科间,以及动、植物界间的生殖障碍,可广泛组合各种基因型,为遗传工程开拓了广阔天地。

  进行动物细胞融合的方法一般有三种:一是利用病毒;二是使用溶血卵磷脂;三是应用显微操作技术,使细胞直接融合。目前应用病毒者居多。此项工作的一般过程首先是在细胞表面布满大量病毒,使细胞彼此粘接而集聚起来,导致病毒外壳与细胞表面同时合并,形成胞质通道,即胞质桥。随着胞质桥数量与体积的增加,通道渐被扩大,最终两个细胞的细胞质混合在一起,从而完成细胞融合(图3-34)。

 

  动物细胞融合成功的关键在于融合细胞的活力、离子浓度、pH值、氧、严格的操作,以及病毒颗粒浓度等。

  目前已实现了人与鼠、人与兔、兔与鸡、鼠与猴、鱼与艾氏(Ehrlicn)细胞、人与蛙以及哺乳动物卵细胞等的体细胞杂交。

  瑞士的K.Illmensee和美国的C.M.Croes等人(1978)培育出携带人类染色体的镶嵌小鼠。他们选用小鼠无胸腺嘧啶核苷激酶的畸胎瘤细胞,与人无次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶的纤维肉瘤细胞,以灭活仙台病毒为媒介,将二者融合,经培养,筛选杂种细胞,发现在杂种细胞内存有1~3条人的染色体,其中包括含有胸腺嘧啶核苷激酶及半乳糖激酶基因的第17号染色体。他们将此细胞注入鼠的胚泡内,再把该胚泡引入“养母”子宫内“寄养”,直至子鼠出生。结果,在子鼠的背部、尾部,胸侧及足端等处出现白毛,形成镶嵌的皮毛(图3-35)。

  实验证明,在鼠胚泡内的人-鼠杂种细胞,与胚泡一样能形成胎儿的正常组织。这对探索遗传发育、肿瘤病理、矫正遗传缺陷,尤其是对人类遗传的研究,都具有十分重要的意义。

 

 

二、染色体工程

 

  早在20世纪30年代,植物育种学家就已利用杂交的方法从事染色体工程,但在当时并没有提出“工程”这一术语。广义的染色体工程包括:染色体组工程和个别染色体工程。

  (一)染色体组工程(genome engineering)

  染色体组工程的主要内容是增加或削减染色体组,以改造生物的遗传基础,达到人类利用的目的。增加染色体组(genomechromosome complement)是使细胞中的染色体多倍化,即变成同源多倍体(autopolyploid)或异源多倍体(allopolyploid)。

  1.同源多倍体 获得多倍体的方法较多,其中秋水仙素诱变的方法应用较为普遍。该诱变机制在于阻止有丝分裂细胞中纺锤体形成,使已经纵裂的染色体在后期不能分开到两个子细胞中,于是便形成了一个加倍的重组核。在植物组织中,分裂旺盛的组织对药液反应大。如用0.2%~0.4%秋水仙素溶液,滴在西瓜幼苗的生长点,每天1~2次,连续两天;又如用0.1%秋水仙素溶液在27℃条件下浸泡黑麦刚刚萌芽的种子,经3~5小时取出,洗净后播种,便可望得到有重组核的多倍体组织。由多倍体组织分化出来的性细胞,产生多倍体配子,通过有性繁殖在后代中保留下来。此项技术已广泛应用于生产实践,先后培育出许多新品种。如三倍体无籽西瓜、四倍体葡萄、三倍体的甜菜等。

  2.异源多倍体 两个不相同的杂交种,它们的杂种再经染色体加倍,就形成了异源多倍体。一个有名的例子是萝卜甘蓝。萝卜(2n=18)和甘蓝(2n=18)杂交。从其后代中发现了能够结实的新种,即萝卜甘蓝是由重组核(2n)的配子相互结合形成的。它的体细胞中含有36个(4n=36)染色体,其中18个(2n)染色体来自萝卜,另18(2n)个染色体来自甘蓝。

  (二)个别的染色体工程亦称狭义染色体工程

  这里仅以三体系统为例,作一简单介绍。在同种植物细胞中添加一条染色体,即2n+1型植物,称三体型植物(trisomics)。创造三体植物一般用三倍体植物与二倍体杂交,可望得到三体型植物。因为在三倍体植物产生的雌配子中应有染色体数为n+1的类型。它们与二倍体植物的雄配子(染色体数为n)受精,产生的合子染色体数则为2n+1,由其发育成三体植物。如曼陀罗、玉米、大麦、黑麦、水稻、棉花、蕃茄等许多植物,都已获得三体系统。

 

三、基因工程

 

  基因工程是把一种生物细胞中的基因(DNA片断)分离提取出来,在体外进行复制,然后通过运载体将复制出来的基因(DNA)引入另一种生物的细胞中,使之与原有的DNA结合在一起,这样来改变生物的遗传结构,经过转录和翻译,子代细胞中就将出现新的遗传性状。近年来,便开始用人工合成的基因,进行遗传工程的实验,在改变遗传性状方面取得明显的效果,遗传工程为人类遗传病的治疗提供了新的可能性。

  现将基因工程的一般过程,简单介绍如下:

  (一)基因的分离

  各种生物中所含的基因很多。例如,最简单的DNA病毒也有近几十年基因,原核细胞有几千个基因,真核细胞则有上万个基因。这些不同的基因,在化学结构上都是由4种核苷酸组成,它们间性质极为相似,这样增加了基因分离和提纯的困难。目前,分离基因的方法有下述几种:

  1.物理化学法

  1)密度梯度离心法:DNAGC对多的双链片段密度大,借此可分离富含GC对的DNA片段。

  2DNARNA分子杂交法:用这种方法除可分离基因外,尚可鉴定基因的碱基序列。

  3)散弹射击法:即用超声波或内切酶等将DNA破碎成很多片段,然后从中选取特定的基因片段。

  1969Shapiro等人用超速离心法,从大肠杆菌中第一次人工分离出一种合成β-半乳糖苷酶的基因。该基因由4100个碱基对组成,长约1.4μm

  2.化学合成法 1970Khorana等用化学合成法,首次合成了由77个碱基对组成的酵母菌丙氨酸tRNA的基因。1976年有人首次合成了大肠杆菌乳糖操纵子的操纵基因,导入细胞后证明具有生物功能;1977年成功的合成了生长激素释放抑制因子(Suppressor)基因,转移到大肠杆菌后,获得了功能性产品。

  3.酶促合成法 RNA的碱基序列比DNA的简单得多,而且容易分离。因此,可先分离出一定的mRNA,然后用逆转录酶催化合成DNA1975年、1977年先后分离出兔与人的珠蛋白mRNA,经逆转录,分别合成了有生物活性的DNA

  目前,应用上述方法已分离出40多种基因,多数是从原核细胞中分离出来的。

  (二)选择运载体

  外源性DNA(外来基因)只有经运载工具的运载才能进入细胞。该运载工具即运载体,它本身是小DNA,可自由进出细胞,并可在宿主(host)体内自我复制。当外源性DNA与运载体相结合进入宿主体内后,也能随着运载体的复制而复制,所以运载体为基因工程不可缺少。

  目前已知的运载体有二类:一类是λ噬菌体和SV40病毒;另一种是细菌的质粒(plasmid)。

  质粒是细菌体内染色体以外的环形DNA,其核苷酸含量仅为染色体的0.1%~10%,可以独立的进行自我复制,有的质粒更可组合到细菌的染色体中,随之一起复制。实验证明,λ噬菌体是基因工程中常用的运载体。SV40病毒的基因组可插入动物细胞的染色体(包括人的第7对染色体)中,所以适于作外源性DNA的运载体。例如,现在已成功的将猴细胞DNASV40载入兔精子,完成受精。

  (三)DNA分子的切断和连接

  在这一过程中,主要通过限制性内切酶和连接酶将DNA在一定部位切断,然后使断端与运载体连接。

  1.限制[性内切核酸]restriction endonucleas [restriction enzyme])简称内切酶,可将DNA在一定部位切开,使成为可供人工处理的DNA片段。不同的内切酶在DNA双链上的切割点各不相同,具专一性。内切酶对邻近切点的两个碱基和与切点位置较远的碱基均具识别能力,一般能识别46个碱基。例如,内切酶ECORI,识别的碱基序列是GAATTC,切点在GA之间(图336)。

  内切酶作用于DNA时,多数不在同一地方切断DNA的两条链。因此,在两断端各留下由几个碱基组成的互补的单链末端,在适当条件下可以再连接起来,所以称为粘性末端(cohesive end)。

  2.DNA连接酶(DNA ligase连接酶能修复DNA分子的切口,在一定条件下除可连接DNA链的游离末端外,还可把内切酶切断的DNA片段,连接在运载体DNA上。

  综上,基因工程可概括如下(图337):

  1)选用内切酶在特定部位切断外源性DNA和运载体DNA,使之产生有粘性末端的DNA片段;

 

 

  2)用连接酶将外源DNA和运载体DNA片段连接起来,形成DNA的重组体或杂种质粒;

  3)将含有连接外源性DNA的运载体(杂种质粒)导入细胞内。这样便完成了把一种生物的基因转移到另一种生物细胞的过程。

  基因工程成功事例较多,选几例作为介绍:

  有人用大肠杆菌质粒pSC50作供体(pSC50有抗链霉素和抗氯霉素的遗传信息),用有抗四环素遗传信息的pSC101作运载体。在体外先后经内切酶与连接酶的切割、连接,形成杂种质粒。导入无抗药性的大肠杆菌细胞中后,在含有链霉素、氯霉素和四环素的培养基中检测,证实受体细菌获得了三重抗药性。

  生长激素释放抑制因子系由14个氨基酸形成的多肽链(图338)。

 

  美国加州霍普市医学中心首先设计了这种激素的遗传密码,然后用化学合成法制备出这种基因(SOm基因)。用质粒PBR322导入大肠杆菌,使在菌体内表达,产生了这种激素(图339)。

  他们用乳糖诱导,使产量增高2.47倍,在7.5h培养液中收获了5mg激素(1978)。在此之前需屠宰50万头山羊,才能从脑组织中提取5mg。为此,加州建立了Genetech公司,用遗传工程方法生产这种激素。

  我国生物学家童第周等(197319751976),从鲫鱼的精巢和肝脏中提取DNA,注入金鱼的受精卵,结果导致表现型的改变,约有1/3个体的尾鳍由双尾变成单尾。自交后,子代中仍有38.30%个体有单尾,说明已传于后代。

  他们还从鲫鱼的卵子中提取mRNA,注入金鱼受精卵,结果也导致33.1%个体表现型改变,自交后,子代中有39.6%个体有单尾,这表明已传给下代。据认为mRNA是在反转录酶作用下,经反转录形成DNA后发生作用。

  目前在真核生物间进行遗传物质转移研究,仅有少量实验在转录水平获得成功,并能达到翻译阶段。

 

 

四、遗传工程发展前景

 

  遗传工程的各项技术操作,在不同程度上取得了显著成果,发展前景无限美好。

  在农业方面,有人设想进行特异性基因转移,培育高产、优质,抗病力强的动植物新品种。其中最引人注目的课题是通过固氮基因的转移,以解决农用肥料问题。比如把固氨基因转移到有实用价值的菌种中,用工业发酵的方法生产氮肥;也有人设想,把固氮基因转移到作物根际的土壤微生物体内,使其直接为作物提供氮肥;还有更为大胆的设想,把根瘤菌的固氮基因转移到粮食作物体内,使作物能直接从空气中摄取养料,从而减少或免施肥料。

  在制药业中,利用基因工程方法合成胰岛素。首先从大鼠胰腺中提取并纯化胰岛素原mRNA,然后用逆转录酶合成相应的cDNA,再以cDNA

  

  两条核苷酸短链。短链中有内切酶HindⅢ的识别序列(↓AGCT),利用PMB9质粒上也有HindⅢ切点这一特点,把胰岛素原基因结合入PMB9质粒中,将这种重组DNA导入大肠杆菌后得到表达。通过化学处理,可以把生成的胰岛素原转变为胰岛素。这样,利用“细菌工厂”,便可生产胰岛素。

  在医学方面的例证较多,这里仅介绍一例。高精氨酸血症是一种隐性遗传的代谢病。患者因缺少精氨酸酶,不能将体内精氨酸分解为尿素和鸟氨酸,结果由精氨酸在血中堆积而产生高血氨。患者有抽搐、痉挛性瘫痪,严重智能发育不全等症状。兔的致癌(乳头状癌)病毒中具有精氨酸酶基因。因此,有人将有此基因的病毒接种于精氨酸血症的患者,以进行基因治疗。由于接种于患者体内的基因产生了分解精氨酸的酶,所以两次接种的三位患者,都取得了一定疗效,患者血液中精氨酸含量约下降20%以上,临床症状获得缓解。

  综上,遗传工程理论与技术的应用,标志着生物科学发展到了一个崭新阶段,已为人们展现出无限美好的发展前景,将成为造福人类的不可缺少的重要手段之一。

  复习思考题

  1.名词解释

  核酸、半保留复制、转化、遗传密码、密码子、反密码子、转录翻译、中心法则、操纵子、结构基因、遗传工程

  2.为什么说遗传物质是DNA而不是蛋白质?

  3.简述DNA的化学组成及其结构特征。

  4.试述mRNAtRNA、核糖体在蛋白质合成过程中的功能。

  5.何谓基因,它在DNA分子上的存在方式如何?

  6.一段核苷酸链的碱基顺序为ATGC,试问:

  1)它是DNA,还是RNA

  2)若是DNA,其互补链的碱基顺序如何?

  3)转录成RNA分子的碱基顺序如何?

  个比例各是多少?

  8.某一mRNA上有70个碱基,其中A15个,G35个,那么转录该mRNADNA分子片段中,GT的个数共有多少?