DNA重组与基因工程

自从DNA双螺旋结构发现以来,生命科学的面貌发生了巨大变化,从分子水平上了解物种进化和亲缘关系,了解生命体系在细胞层次和系统层次的活动规律有了长足的进步,它所取得的成果,已经在工业、农业及医药卫生等方面有了重要应用。DNA重组技术是指将不同的DNA片段(如基因等)按人们的设计方案定向连接起来,并在特定的受体细胞中,与载体一起得到复制与表达,使受体细胞获得新的遗传特性。从某种意义上说,DNA重组技术也可理解为基因工程。严格说,基因工程的涵义更为广泛,还可以包括除DNA重组技术以外的一些其他可使生物基因组结构得到改造的技术。限制性内切酶与DNA连接酶的发现与应用是DNA重组技术得以建立的关键。现在,人们能够在体外直接操作基因,改造其遗传特性,使基因在不同个体,甚至在远为不同的生物种属之间的转移成为现实。这为某些遗传疾病的治疗和新品种的培育提供了前所未有的可能性,从而为人类健康、农业增产,以及控制和改造整个地球上的生物界展现了无限广阔的美好前景。

 

1  基因工程的原理与步骤

 

基因工程始于70年代初。1973年美国斯坦福大学科恩研究小组首次将大肠杆菌中两个不同的抗药性的质粒(一种在细菌染色体以外的遗传单元,通常由环形双链DNA构成)结合在一起,构成一个杂合质粒,再引入大肠杆菌。结果发现这种杂合质粒不但复制,而且能够同时表达出原来的两种抗药性。第二年科恩等人又用金黄色葡萄球菌中的抗药性质粒与大肠杆菌的抗药性质粒结合,得到了同样结果。接着他们又进一步用高等动物非洲爪蛙的决定核糖体RNA结构的基因(rRNA)与大肠杆菌的质粒重组到一起,并引进到大肠杆菌中去,结果发现爪蛙的基因在细菌细胞中同样可以复制与表达,产生出与爪蛙核糖体RNA完全一样的RNA。科恩等人的工作证明,人们可以根据自己的意愿、目的,通过对基因的直接操纵而达到定向改造生物遗传特性,甚至创造新的生物类型。

基因工程一般要经过五个步骤。第一步是目的基因的分离与制备,其方法主要包括从细胞中分离提纯和人工合成。人工合成是指先通过化学合成方法合成出一个个小的DNA片段,然后再用连接酶把这些小片段联接成为一个完整的基因。

第二步为目的基因与载体的连接。虽然直接把目的基因引入变体细胞,这也不是不可能的,但多数情况下因每种生物经过漫长的进化演变,已具有抗拒异种生物侵害而保存自己种族的本领。所以,当外源DNA赤裸裸地进入细胞后往往会被一种叫做限制性内切酶的酶类破坏分解。这就需要一种能够把目的基因安全送进受体细胞的运载工具,即载体。这些载体除能比较方便地进入受体细胞外,还要能在受体细胞中复制自己,以便扩增。此外,基因工程中所应用的载体往往带有一定的选择标记和特定的酶切位点,这样可以方便选择和装拆外源DNA。最常用的载体是质粒(如大肠杆菌质粒pBR322)和病毒(如λ噬菌体——一种细菌病毒,为双链DNA)。外源DNA与载体DNA连接即形成重组DNA。在连接过程中通常需要两种酶:限制性核酸内切酶(能特异性的切断DNA链)和连接酶。

第三步为将重组DNA引入受体细胞。重组DNA分子建立之后,还要引进到受体细胞中去,使细胞获得新遗传特性,此过程称为转化或感染。目前基因工程的受体细胞主要是细菌,因为细菌具有操作方便,易于培养,繁殖迅速等优点。

第四步为筛选出含有重组体的克隆(即复制)。由于细胞转化的频率较低,转化率一般在10-6水平,即转化后的带有重组DNA的细菌只占其总数的百万分之一,所以必需用一些方法进行检出和筛选。然后对筛选出的含有重组体DNA的细胞进行克隆。图611DNA重组体的构建与克隆示意图。

通过以上步骤,便得到了带有异源目的基因的细菌。第五步就是要使这些带有异源目的基因的细菌得到表达,生产出人类所需要的产品。

人们已经成功地利用这种将外源基因导入细菌中的技术,将人或动物的某些基因(如胰岛素等)导入大肠杆菌,取得了举世注目的巨大成果。

 

2  基因工程在农业和医药领域的应用

 

长期以来,人们用动植物和微生物手段(即杂交和选择)来培养植物和动物新品种。后来又发展到人工诱变。但是,不同物种之间的生殖隔离给种间杂交带来了极大的困难。同时,人工诱变又不能定向,所以以往的育种工作带有很大的盲目性,并且效率极低。许多育种专家一生的心血只能培育出几个优良品种。从理论上讲,基因工程可以把任何不同种类生物的基因组合到一起,使得它具有所需要的遗传特性,这是人类向育种的自由王国迈出的一大步,使得在定向改造生物本性方面具有了前所未有的预见性和准确性。

在农作物中,已成功地对马铃薯进行了改造,不但使其获得了抗病毒基因,而且也得到了高蛋白质含量的马铃薯新品种。把一个蛋白水解酶抑制剂基因引入烟草之后,使得以烟叶为食的害虫不能消化其中的蛋白质而无法繁殖,从而这一烟草品种就获得了抗虫害的能力。对蕃茄的基因改造得到了比较不易软化和擦伤的品种,因此可以在成熟后收获并且保存较长时间,也避免了过去在成熟前收获而口味不好的缺点,该产品已经在美国上市。虽然植物基因工程的应用还刚刚开始,但为农作物的大量增产和品种改造提供了无法估量的发展前景。

基因工程在医药领域也有广阔应用前景。水蛭素是从水蛭中提取到的一种抗凝血、抗血栓药物,它是由65个氨基酸组成的多肽。由于医用水蛭来源有限,直接从中大量分离水蛭素供给治疗需要是不可能的。现在可以利用基因工程技术大量生产水蛭素。重组水蛭素与天然水蛭素的药理活性基本相同。

组织血栓溶酶活化蛋白(TPA)是另一种有助于溶化血栓的蛋白质,但在生物体中含量甚微,不可能用天然来源制备这种药物,现在已经能够用基因工程技术大量生产,并被用于中风的预防和治疗中。仅此一产品,年产值已达2.3亿美元。治疗糖尿病的药物胰岛素,也已用基因工程的方法来生产,年销售额约5.7亿美元。

目前世界上的生物工程公司已经在几年前纷纷建立的基础上取得了很大发展,各种疫苗、抗生素、激素、酶等产品可利用基因工程技术大量生产。估计到1997年生物高技术产品的世界销售额将达71亿美元。

 

3  人类基因组工程与基因治疗

 

应用DNA重组技术,可以很容易地将各种生物体的全部基因组的遗传信息贮存在可以长期保存的、稳定的重组体中,以备需要时应用。这好像将文献资料贮存于图书馆一样,所以称基因文库(ge-nomic library)。人类基因文库的建立是一项意义重大的工程,称为人类基因组工程。

在这项工程中,科学家正在进行巨大的努力,要在21世纪初(约2005年)弄清人类8万个基因中每个基因所含的4种核苷酸(共30亿个碱基对)的排序,以及每个基因在23对染色体中的确切位置,从而确定全部的人类基因,从中了解控制生命过程的全部信息。从现在的技术发展速度来看,完成这项工程大约需要1015年时间,投资30亿美元,全部完成后,如果印成书,以每页3000个印刷符号计,会有100万页。这将远远超过现有的任何一种百科全书的篇幅。

就像19世纪末发现的元素周期律为20世纪作好准备,使化学工业、量子力学理论出现了大发展一样,人类基因组工程将为21世纪的发展作好准备,它能够产生对待现在还不能控制的各种危及人类生命的常见病、遗传病以及癌症等的根本方法和技术。有了这个巨大的基因数据库,人们就可以知道每个基因所发挥的作用,并确定哪些基因与疾病有关。通过这种方法可以找到致病的原因,然后对有关的基因进行修复、校正等特异性的“治疗”,从而达到根治疾病的目的,这就是所谓的基因治疗。预计在不远的将来,许多遗传疾病和癌症可望通过基因治疗得到根治。

人类的遗传疾病是由于基因上的缺陷导致某些蛋白质制造能力的丧失而引起的。早已知道镰刀状贫血病是由于血红蛋白基因中的一个核苷酸T突变为A(遗传密码由CTT变为CAT),造成蛋白质中的一个谷氨酸被缬氨酸代替,从而引起脱氧血红蛋白溶解度下降,在细胞内成胶或聚合,使红细胞变形成为镰刀状,并且丧失结合氧分子的能力。另外一种比较常见的遗传病是由于编码苯丙氨酸羟基化酶的基因丢失,人体不能合成苯丙氨酸羟基化酶,造成苯丙氨酸在人体内的积累而引起的痴呆症。利用DNA重组技术,人们可以用正常功能的基因片段去替换或插入有缺陷的基因片段中,来治疗遗传性疾病。这种方法由于涉及到对异常基因进行“修补”,所以称为基因修补。基因修补是基因治疗方法中的一种。基因修补可望在21世纪中叶成为根治遗传性疾病的实用手段。