基因治疗和传统的基因工程的区别

  基因治疗和基因工程都着眼于有治病或有其他应用价值的“目的基因”。但基因工程是将“目的基因”放在一个载体内,然后导入大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞在体外表达出所需要的蛋白,经过分离纯化获得能用于治疗或其他用途的蛋白纯品。因此,基因工程在医药方面,最终是制造出一种蛋白类的药物。基因治疗则不同,它是将目的基因放进特定的载体中,然后导入人体,要求这种基因在人体细胞中能制造成我们所需要的蛋白,通过它来达到治病的目的。
  由此可以看出,如果基因治疗在技术上获得成功,它将具有以下优点:①它的制品将是基因及其载体,而不是基因表达的蛋白产物,故它不需要基因工程所需要的、复杂的对蛋白产物分离。纯化工艺;②它所需的生产成本将远远低于基因工程产品;③从理论上来说,它具有更大的潜力。即凡能治病的基因,都有可能开发成为“药物”。
  但是,基因治疗有它的难度,技术要求极为苛刻。例如,针对各种疾病,必须具有能够达到治病目的的基因。在此基础上,还必须具有能有效地将基因导入人体的载体系统,这种系统要求高效,而且能定向地导入人体某种细胞。基因导入人体后,必须能够控制它的表达。
  因此,基因治疗将是生物高技术的高度集成,是遗传学、分子生物学、细胞生物学、分子病毒学等多种学科知识和技术的高度综合。
  美国从80年代开始,对基因治疗进行长期的研究和积累。从1989年起,正式由美国FDA批准开始进入临床试验阶段。预期不用多久,将会对恶性肿瘤、老年性退化性疾病、心血管疾病和遗传病这些难治之症提供一种新的治疗途径,并成为恶性肿瘤常规治疗手段(手术、放疗、化疗)的一种重要补充。但从日前来看,由于它的技术难度极大,现阶段只能说是起步阶段,预期要到2010年后,才能发展成为一种常规的治疗手段。

基因治疗研究问题之一

  1995年,美国对基因治疗的临床方案进行了评估,结果有效者寥寥无几。其原因在于对基因治疗缺乏实事求是的态度和报道失实,技术路线及设计存在严重的问题。这些都应引以为戒。其中关键问题有三个:
  能有效治病的基因为数太少是关键之一。以恶性肿瘤为例,在基因治疗方案中,所用的基因大致可归为三类:一是细胞因子类;二是杀伤性基因类,以疱疹病毒I型胸苷嘧啶激酶(HSV I TK)为代表;三是以p53为代表的抑癌基因或癌基因的反意基因类。按其作用的机理也可归纳为两大类:一是针对癌细胞杀伤或抑制其生长;二是通过增强癌细胞的抗原性或增强机体免疫细胞系统对肿瘤杀伤的免疫基因治疗。上述基因用于肿瘤治疗,除脑恶性胶质细胞及p53基因治疗某些肿瘤看到近期疗效外,其他治疗效果均不太理想。现对以上基因作如下分析:

  HSV-TK基因及其他杀伤性基因    这类杀伤性基因均基于将药物前体变换为高毒性的代谢物(如GCV变成GCV三磷酸),其作用点是干预DNA的合成,与一般核酸代谢类化疗药物无差别,因而对正常的增殖细胞与癌细胞均有杀伤作用。至于用于脑瘤有某些效果,是由于脑内神经原细胞不分裂,增殖细胞只有胶质瘤细胞及其周围增殖的胶质细胞或血管内皮细胞,故对脑神经原损伤甚少。颅内注射对于颅外系统(包括骨髓)受损更为轻微。但若将HSV-TK基因用于其他脏器的肿瘤,尤其是肝癌,癌旁肝细胞由于存在肝炎或肝硬化,均有大量再生肝细胞,同样属增殖细胞,各种抗代谢类药物同样将予以杀伤。这是化疗中的一个常识问题。对一般器官肿瘤的基因治疗,由于载体不专一,必然会把杀伤性基因部分带到非靶器官或肿瘤以外部位,造成副作用。另一方面,在缺少有效的载体系统情况下能导入基因的肿瘤细胞仅占总数中很少比例,仅靠“旁观者效应”远远不足以消灭肿瘤。

肿瘤的抑癌基因、癌基因的反意基因及诱导凋亡的基因
  抑癌基因如p53或Rb无疑是很好的候选基因,它可抑癌并诱导凋亡。但存在问题是基因太少,导入癌细胞中易于突变。如作者发现肝癌细胞导入p53后,部分细胞受抑制,20%左右未受抑制的癌细胞中导入的p53又发生突变(未发表材料)。癌基因的反意基因(如ras,c-myc)均可抑癌,亦可诱导细胞凋亡。但能直接诱导凋亡的基因将有更好的前景。理论上这类基因应对增殖的正常细胞制于Go期,而对癌细胞则诱导凋亡。因此分离诱导肿瘤细胞凋亡基因对肿瘤基因治疗甚为重要。

应用细胞因子或其他基因增强机体对肿瘤细胞的抑制作用
  这包括应用细胞因子增强肿瘤细胞的免疫原性或增强免疫效应细胞对肿瘤细胞的杀伤或抑制作用,所应用的基因包括以下几类:一类为细胞因子或其他基因体内直接导入肿瘤细胞或在体外制备瘤苗。如IL-2,IL-12,TGFβ(反意基因)等细胞因子基因,也包括某些受体基因(如TNFα受体等)。此外还包括导入MHC I类基因及共刺激回子如B7属基因以及肿瘤抗原基因(如黑色素瘤抗原MARTl,gp100等)以增强肿瘤细胞的抗原性。也有试图应用针对肿瘤细胞过量表达的受体(如erb B2)单链抗体基因,导入细胞形成所谓胞内抗体(Intrabodies)等。另一类即将细胞因子或其他基因导入免疫效应细胞。如S. Rosenberg将TNFα,IL-2导入肿瘤浸润淋巴细胞(TIL),其他如INFγ,IL-10等细胞因子导入CTL等。
  以上研究,在动物实验中均取得一定效果,但应用于人体的效果仍令人担扰。除了缺少有效的载体系统(以下再讨论)外,从免疫学本身还存在以下几个主要问题:①细胞因子及受体的网络及其相互作用的机理尚未搞清,例如一种细胞因子可以影响另一种细胞因子受体的表达。这在CSF系列已屡见不鲜。因此,强调一种因子在体内高表达,其旁观效应尚不清楚。②细胞免疫应有三大环节:一是靶细胞表面的抗原以MHC表达;二是T细胞对靶细胞抗原的识别;三是一直被人忽视的抗原提呈细胞(APC)系统,包括巨噬细胞及树突状细胞(DC)。如果缺少了第三方面,细胞免疫反应不能完成。目前对APC系统开始受到重视,这是值得研究的重要领域。③肿瘤患者不同于动物的移植性肿瘤。在长期的致癌、癌变及癌的演进过程中,以上三方面均可能存在缺陷。而三者的缺陷状态又因癌的发展阶段、癌的种类以及人的免疫遗传学的个体差异等有所不同。因此,免疫基因治疗今后必须是“个体化”的策略,根据个体的致癌、癌变及癌的演进三方面的缺陷按例而治。这就必须加强肿瘤免疫学基础的研究和建立一系列的检测手段,否则均会陷于盲目性。
  以上仅举肿瘤的基因治疗为例,至于对常见的遗传病、心血管疾病(如高血压)、代谢病(如糖尿病II型)、神经性疾病(如Alzheimer氏病、帕金森病等)、其“靶基因”属多基因,而且迄今尚未搞清。总之,目前可供基因治疗的有效靶基因太少。这将有待于人基因组计划的实施及疾病相关基因的发现,才能逐步解决这一关键问题。

基因治疗研究问题之二
  尚无高效、靶向的基因导入系统是关键之二。虽然目前有许多载体系统,惜乎没有一个载体可以达到导向、高效地把基因导入体内的靶细胞。不少临床治疗方案失败于不合要求的载体。目前已批准用于临床及正在研究的载体系统罗列于下。

  病毒型载体 ①逆转录病毒载体:其最大优点是安全,其次是针对增殖的细胞,但最大缺点是低效(导入率小于7%),且无导向性。导向的重组膜蛋白的逆转录病毒滴度太低,距实用尚存在很大距离。②腺病毒载体:第一代重组腺病毒载体的最大优点是高效导入和高滴度,其次是非增殖细胞也可导入(对遗传、代谢病来说是优点);最大缺点是严重的免疫反应(部分病例)以及受体被饱和,其次是无导向性。现在寄希望于第二代载体(即降低免疫原性而保留其与受体结合的功能)。③疱疹病毒载体:其安全性尚无人体资料。但其嗜神经性的特点,可能对神经性疾病有潜在应用前景。④腺相关病毒(AAV):其优点是导入基因后可特殊表达,但未改造的腺相关病毒滴度太低而难以应用于临床。目前也寄希望于改造AAV的包装体系能克服这一缺点。⑤其他病毒:EBV也有可能成为一种新载体,现在寄希望于我国科学家的努力(预防医学科学院病毒所)能获成功。

  非病毒型载体 ①脂质体:脂质体最容易制备,却也最难达到质控要求。虽然不少文献上仍用脂质体(如阳离子型),但体内基因导入效率低,且无靶向性。在体内应用,除肿瘤瘤内注射外,其前景仍存在问题。此外,在质控上也有一定困难。②裸DNA:基因质粒DNA导入肌肉,可以达到表达。但表达量低,除非另有载体系统或应用“基因枪”,仅靠注射裸DNA,要达到治疗目的,对极大多数疾病还存在困难。③多肽-多聚赖氨酸作为受体的导入系统:作者实验室曾设计(与北京医科大学合作)以内皮素拮抗多肽为导向的载体,证明可将DNA导入内皮细胞。近年来,已设计了应用IGFII、EGF等多肽片段,实验结果指示,这些多肽为导向的复合物,将基因导入相应受体高表达的细胞,具有较高的效率。但其应用的前景有待于体内实验及临床试验的验证(以上受体为靶向的载体已申请国家及国际专利)。

基因治疗研究问题之三

   基因的表达及其可控性是关键之三。在多数情况下,期望导入基因能高表达而且可受某些因子的调控,即可控性表达。但目前表达量尚不够理想。近年来,在提高表达量方面已有不少改善的尝试,如改变启动子,加入可剪接的内涵子序列,改变Poly A序列等,可显著提高某些基因(cDNA)的表达。因此,提高基因在体内表达仍是基因治疗的一个重要关键。难度最大的问题是导入基因的表达可控性问题。这在肿瘤基因治疗尚不是首要问题,但对于代谢病、心血管疾病等却至为关键。例如溶栓酶、胰岛素基因,若导入体内表达而无调控,将造成灾难性危险。1996年5月,美国报道了TAXI/UAS调控系统,应用酵母GAL 4序列插于目的基因上游区,组建一个孕酮受体激活区与GAL 4基因DNA结合区的融合基因。当两个基因共转染靶细胞时,目的基因并无表达,只有与孕酮类似物存在时,开始激活目的基因的表达。对于该报道,其基础表达是否等于零(尤其在人体)尚有待证实,但这种思路有借鉴的价值。

根据基因治疗的前景及存在的问题,我国的基因治疗研究应注意以下几个方面:
  不要“人云亦云”,排除国外的“热”与“冷”影响,立足于科学技术本身的发展规律来确定我国基因治疗研究的地位、攻关的内容、投资强度及配套设施的建设。应该既看到基因治疗的可喜前景,这是人类治病的一项新途径;又看到技术上还存在有待解决的难题,这是一个跨世纪的工程,要扎扎实实工作。 
  目前应把基因治疗研究的重点放在应用基础上,即实验室研究方面,加强基因导入系统和基因表达的可控性研究,结合人基因组研究,寻找更为有效的“目的基因”。这应该是战略重点。
  对少数比较成熟的项目,在严格通过卫生部药审后进行临床试验。对不通过国家药审而擅自进入临床试验的这种非法行为,必须坚决予以制上。